人工設計與合成小基因組原核細胞

Venter?研究組于?2010?年報道了人工全合成和組裝?1.08?Mbp?的絲狀支原體?JCVI-syn1.0?基因組，并將其移植到受體山羊支原體細胞，創造出新的細胞具有絲狀支原體細胞的信息和特征。這是一個龐大的工程，參與該項目有?20?多人，歷經了?15?年，花費了?4?000?萬美元，從而最終完成了這一重大的人工合成基因組的任務。在全基因組合成和拼接中，需要多級的質量監控，以保證合成出來的基因組序列的精確性。例如，Venter?團隊曾經因為一個堿基的錯誤而使得細胞不能存活——在調控染色體復制的生存必需基因?dnaA?中的一個堿基缺失造成基因的讀碼框移位，一個小的錯誤曾經耽誤了他們不少的時間。這個例子表明細胞的存活是需要精確調控的。Venter?等人合成的基因組幾乎跟天然的基因組一樣，要理解、設計和改造生命系統，僅僅拷貝并合成一個天然的小基因組是不夠的。

那么如何設計并合成一個比天然更小的基因組呢？Venter?團隊從全合成的生長比較快的?1.08?Mbp?的絲狀支原體?JCVI-syn1.0?基因組出發，通過多輪的設計—合成—測試，最后成功合成出了?531?kbp?且可存活的最小基因組的?JCVI-syn3.0。這個?3.0?版本比天然最小的?583?kbp?的生殖道支原體基因組更小，生長卻是更快，代時僅有后者的?1/5。這被認為是接近于最小基因組的版本了。

這個成功的背后是超大量的設計、合成和測試工作。首先，他們發現基于已有知識設計最小基因組是不可行的。通過整合現有的轉座子突變和敲除數據，以及分子生物學累積的知識，從?1.08?Mbp?的絲狀支原體基因組?JCVI-syn1.0?中找到了可敲除的?440?個生存非必需基因，使得基因組減小到了?483?kbp。他們將這個預設的?483?kbp?的最小基因組分成?8?個大段，分別合成和測試功能。結果?8?個大段中僅?1?個大段是有功能的，但是該段的設計改造使得細菌生長很不好。導致前期的設計失敗的一個重要原因是在生存必需基因（e）及非必需基因（n）之間，還存在對生長重要的準-生存必需基因。根據準-生存必需基因對生長的影響情況，他們還分了非常影響生長的基因（ie）、影響生長的基因（i），以及輕微影響生長的基因（in）。他們認為應該保留生存必需的基因?e?以及影響生長的?ie?和?i，只把基本不影響生長的?in?和?n?作為敲除的備選基因。除了準-生存必需基因之外，還存在執行生存必需功能的冗余基因。比如，基因?A?和?B?都能執行生存必需功能?E，單敲除?A?或者?B?都不影響生存必需功能?E，那么我們一般會認為?A?和?B?都是生存非必需的。但是?A?和?B?的同時缺失將導致生存必需功能?E?的缺失而使得細菌不能存活。因此，需要大量的測試工作來尋找這些準-生存必需基因，以及執行生存必需功能的冗余基因。

值得注意的是，在基因組減小的過程中，基因組大小和生長速度之間有一個平衡。隨著基因組的減小，生長速度急速減慢。人工設計及合成出來的?531?kbp?支原體最小基因組?JCVI-syn3.0?代時為?180?min，比?1.08?Mbp?的支原體基因組?JCVI-syn1.0?的?60?min?的代時要慢很多。并且，它不像出發菌株那樣可以在液體培養基中形成均一的混懸液，而是容易沉淀。顯微鏡和電鏡下可以看到JCVI-syn3.0?細胞容易形成長的細絲狀的網絡結構，也會形成大的泡囊體。因此，這個接近于最小基因組的細胞的生長還是有缺陷的，不那么完美。但是，無論如何，這是一個成功設計與合成最小基因組的范例。

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