基于同尾酶的BioBrick法和BglBrick法。同尾酶是識別不同的?DNA?序列但是能切出相同黏性末端的一類限制性內切酶，比如?XbaI?和?SpeI，但其切開的末端相互連接后不會再形成原酶切位點。利用這種“單向”的連接特性，可設計多輪連接以實現?DNA?片段組裝。根據此原理設計的?BioBrick（生物積塊）法（圖?2b）可用于合成生物學中相關元件的標準化組裝，但因其連接處會留下能編碼終止密碼子的痕跡序列，故不適用于融合蛋白的組裝。為此?Anderson等采用?BglII?和?BamHI?替代?XbaI?和?SpeI，其切割末端連接后產生的痕跡序列可以編碼對大多數融合蛋白無影響的“甘氨酸-絲氨酸”連接肽，此策略命名為?BglBrick?法。

基于?IIS型限制性內切酶的策略。BioBrick?和BglBrick?法雖然可以實現高效率的基因部件組裝，但是其無法避免引入額外的痕跡序列。除了同尾酶，限制性內切酶中還存在一類?IIS?型限制性內切酶，其識別位點和切割位點不在同一個位置，因此可以根據需要放置內切酶的識別位點，以產生所需的黏性末端，用于多片段的無縫連接。2008?年，Engler?等根據此原理設計了?Golden Gate?拼接法，其可在一個反應體系里面實現多片段的高效無縫連接（圖?2c）。筆者實驗室在?Golden Gate?拼接法的基礎上，設計了?YeastFab和?EcoExpress兩個組裝系統，用于工程細胞的代謝通路優化和蛋白表達，可達?90%?以上的?DNA?拼裝效率。

基于多工具酶聯合體系。無論是基于同尾酶還是?IIS?型限制性內切酶的連接法，由于其產生的黏性末端堿基數有限，難以支持更大片段的連接。實際上，體外的?DNA?片段連接，其核心都在于單鏈重疊區的產生和利用。為克服內切酶產生黏性末端長度不足的缺陷，Gibson?等直接放棄限制性內切酶，采用?5′?核酸外切酶，聯合?DNA?聚合酶以及?DNA?連接酶，開發了?Gibson?組裝法（圖?2d）。此方法一方面可以實現無縫連接，沒有痕跡序列的殘留；另一方面其能連接獲得的片段大小可達幾百?kb（千堿基對），大大提高?DNA?體外組裝所能達到的量級。

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