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DNA的合成、組裝及轉移技術

發布時間:2018-11-16 17:16:22  |  來源:中國網·中國發展門戶網  |  作者:盧俊南 羅周卿 姜雙英等   |  責任編輯:趙斌宇
關鍵詞:合成生物學,合成基因組學,DNA合成,基因組拼裝,基因組轉移

DNA元件的標準化設計。為了最大化的降低對?DNA?片段的重新合成,提高對已有?DNA?片段的利用率,合成生物學的一個重要研究方向是推進合成片段(生物元件)的標準化。上述提及的?BioBrick?就是標準化的實現形式之一,是合成生物學領域最早建立的?DNA?標準化組裝方法。但是?BioBrick?法在被連接的元件之間留下的痕跡不利于蛋白元件的組裝。BglBrick?法就是為解決?BioBrick?的缺陷而產生的標準化策略。我國王金課題組用歸位內切酶代替常規的?II?型限制性內切酶建立了?iBrick?標準,同時基于?CRISPR/Cpf1?技術開發了?C-Brick?拼接標準。基于?IIS?型限制性內切酶的Golden Gate?標準,包括?MoClo和?GoldenBraid 2.0,也能通過統一的方式進行元件的組裝。針對?Golden Gate?等標準的不足,王金課題組建立了?MASTER?連接法以實現更大片段的無縫克隆。此外,還有與?iBirck?標準類似的?HVAS?法,與?MASTER?類似的?GreenGate?法等。不同的實驗室如果都按照上述的方式對生物元件進行標準化,將能促進生物元件的流通和共享,提高復雜生命系統合成的效率。

胞內組裝

盡管體外拼裝的片段大小可達幾百?kb,但是所得的量往往不足以進行后續實驗,需要使用大腸桿菌等進行擴增。對于?Mb(百萬堿基對)級別的體外組裝尚未見報道,即使假設能體外組裝成功,可能也無法導入到大腸桿菌內進行擴增。而枯草芽孢桿菌、酵母及工程改造的部分細菌(超表達?T4 DNA?連接酶或整合?λRed?重組酶)等微生物本身就可以介導?DNA?的胞內重組連接,可直接將需要組裝的?DNA?片段導入這些宿主細胞內進行組裝。酵母作為常用的?DNA?重組宿主,其高效的同源重組性能早在?40?多年前就已被發掘。1991?年,Silverman?等報道酵母可以實現長達?2?Mb?的人工染色體組裝。而?2010?年,Gibson?等報道合成世界上第一個人造生命體,其長達?1.1?Mb?的合成基因組也是由酵母拼裝獲得。借助于酵母強大的同源重組能力,Sc2.0?項目(酵母基因組合成計劃)利用?SwAP-In?的方法實現了天然染色體的置換,獲得完全合成的人工染色體。2018?年?8?月,Shao?等報道其將釀酒酵母?16?條染色體合并為?1?條長度達?11.8?Mb?的染色體,并獲得有正常功能的單染色體酵母菌株。帶有?1?條染色體的酵母,可作為一個新的研究平臺,增進我們對染色體重組、復制和分離機制的解析,具有重要的意義。此外,該研究的結果也說明釀酒酵母對染色體長度驚人的容忍度(至少可以長達?12?Mb),這為利用酵母構建高等生物的超長染色體提供了理論依據,有利于后續?GP-write?項目(基因組編寫計劃)的開展。

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