野生型基因組清除技術(shù)

合成生物學(xué)目前尚未能完全從頭合成一個完整的細胞結(jié)構(gòu)，只能借用已有的宿主細胞。為獲得只含有人工合成基因組的生命體，需要采取一定的策略將野生型染色體清除。

基于負篩選的染色體清除策略

即使在人工染色體已經(jīng)植入宿主細胞并能發(fā)揮功能的情況下，對應(yīng)內(nèi)源染色體在自然狀態(tài)下丟失的概率依舊極低，需要通過篩選才有可能獲得這類細胞。Li等曾報道用正負篩選聯(lián)合的策略成功去除?21?三體綜合征患者誘導(dǎo)多功能干細胞（iPSCs）中的一條?21?號染色體，使其核型恢復(fù)正常。他們把一個同時編碼負篩選標記和正篩選標記的雙功能融合基因敲入到?21?號染色體；通過正篩選獲得融合基因整合的細胞株，并從中進一步篩選獲得融合基因單拷貝的細胞株；接著在無正篩選藥物的條件下培養(yǎng)，產(chǎn)生攜帶融合基因的染色體丟失的細胞。由于負篩選基因能將無毒的負篩藥物轉(zhuǎn)化成有毒的物質(zhì)，進而把宿主細胞殺死，故可以通過負篩選富集獲得一條?21?號染色體丟失的細胞株。通過正負篩選策略進行合成染色體轉(zhuǎn)移后的內(nèi)源染色體的清除，需要依賴于首先將正負篩選融合基因插入指定的內(nèi)源染色體。近年來，基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展有望進一步提升該策略的效率。

Cre-loxP?介導(dǎo)的染色體清除

Cre是一種重組酶，能識別?DNA?上的?loxP位點，并能根據(jù)兩個loxP?位點的排列方向?qū)⑵渲g的?DNA?片段進行刪除、倒置等。此方法也可用于內(nèi)源染色體的清除。通過與鼠胚胎干細胞（ESCs）融合，人成體細胞細胞核可以被重編程，獲得多能性，但需要在重編程后將?ESC?來源的相關(guān)染色體清除。為達到此目的，Matsumura?等設(shè)計了一個基于?Cre-loxP重組系統(tǒng)的策略——CEC（chromosome elimination cassette）。CEC的中部攜帶一個熒光報告基因和一個抗藥篩選標記，其兩端分別加入一個?loxP?位點，二者相向排列。Cre?介導(dǎo)的姐妹染色體重組，可以產(chǎn)生雙著絲粒染色體和無著絲粒染色體，此類異常染色體可在細胞分裂中被清除。然而，與基于正負篩選融合基因的策略類似，都需要事先對目標染色體進行相關(guān)基因的敲入操作。

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